探究大曲中酯化活性的主要影响因素并鉴定其水相酯合酶
脂肪酸乙酯能为发酵食品增添风味。酯合成酶对于风味酯的合成至关重要，而作为发酵剂的大曲是该酶的主要来源。然而，目前对大曲中酯合成酶的微生物来源及其特性知之甚少，这限制了提高酯化作用的针对性策略的实施。
2025年4月，由四川大学Yu Tian为第一作者，在期刊《Food Bioscience》（IF=4.8）发表题为“Investigating the main contributors to esterification activity and identifying the aqueous-phase ester synthases in Daqu”的研究性论文。本研究基于全长测序和分子模拟方法，对大曲中的产酯微生物及其水相酯合成酶进行了研究。研究加深了对大曲中产酯微生物和酯合成酶的认识，有助于在复杂的发酵生态中识别产酯微生物和酯合成酶。
️一、酯酶活性、理化化合物以及挥发性代谢产物的变化
大曲发酵期间，监测了酯化活性与理化因素变化。前5天，酯酶活性微升，理化参数显著变化；第8至18天，酯酶、氨基酸及醇类显著增加，总酸与水分下降，表明微生物活跃，此为酯酶产生关键期，第18天酯化活性达峰值74.91%。随后活性稳定，温度降至30℃。研究表明，水分与温度是微生物群落演替关键，低水分低温会抑制其活性。30天后，大曲水分与温度下降，可能限制微生物活性。此外，发酵中微生物挥发性代谢产物变化显著，鉴定出36种高置信度代谢物，酯类成分与酯酶活性差异表明微生物群落明显转变。
图1. 理化参数及挥发性化合物的变化情况。（a）理化参数。（b）挥发性化合物。
️二、大曲发酵过程中微生物群落的变化
大曲样品稀释与香农-维纳曲线均趋饱和，表明测序深度足以分析群落。研究聚焦相对丰度（RA）>1%的优势微生物。至发酵第三天，原生小麦微生物显著减少，优势真菌群落占比90.25%-94.10%，包括纤维弧菌、白地霉等。第11天前，纤维弧菌等为优势真菌，之后丝状真菌丰度增加，总丰度25.88%-43.16%。酯化活性11天后渐增，丝状真菌或起关键作用。真菌PD指数与酯化活性回归分析亦显示真菌群落的重要性。细菌优势群落占比78.31%-83.82%，成团泛菌等始终高丰度，且能分泌水解酶。细菌PD或香农指数与酯化活性无显著相关。
图2. 大曲发酵过程中微生物的演替情况。
图2. 大曲发酵过程中微生物的演替情况。（a）真菌群落的演替。（b）细菌群落的演替。（c）酯化活性与微生物群落PD指数的相关性分析。（d）酯化活性与微生物群落Shannon指数的相关性分析。
️三、大曲中分离的优势物种酯化活性的研究
通过分离、纯培养及16S/ITS rRNA测序，确定了大曲主要土著菌株，构建系统发育树揭示17种主要物种，含5种丝状真菌、5种酵母及7种细菌。值得注意的是，高丰度的雪白丝衣霉等菌株未能被分离。酯化活性分析表明，所有丝状真菌均能分泌乙酯合成酶，黑曲霉酯化活性最高，达成熟大曲的72.79%，突显其潜在应用。优势酵母在小麦发酵中未能有效分泌乙酯合成酶，但酵母的酯合成机制需进一步研究。细菌中，贝莱斯芽孢杆菌和考氏杆菌酯合成酶分泌能力较弱。大曲中的主要丝状真菌酯化活性优异，但水相酯合成酶基因尚不清楚。
图3. 大曲中优势物种菌株的酯化能力分析。
图3. 大曲中优势物种菌株的酯化能力分析。（a）优势物种真菌菌株的系统发育树。（b）优势物种细菌菌株的系统发育树。（c）真菌在小麦发酵中的酯化能力。（d）细菌在小麦发酵中的酯化能力。
️四、角质酶水相酯化活性的研究
研究显示，黑曲霉具备高效分泌乙醇合成酶的能力，其基因序列已测序并注释，故进一步研究其乙酯合成酶。先前研究指出，源自紫色红曲霉的角质酶LIP05能高效催化水相中的乙酯合成，其盖帽结构域在酯化时发生构象变化，暴露活性位点，且该结构域限制催化活性。去除此结构域后，LIP05-50酯化活性提高52.5%。在UniProt数据库中，发现多种缺乏盖帽结构域的真菌角质酶，可能增强酯化活性。本研究中，五种来自黑曲霉的非冗余角质酶被命名为ANC1至ANC5，其中ANC5在水相中酯化活性较高，但酯水解活性也强，而LIP05更具选择性。通过分子对接和动力学模拟，研究了这些角质酶的催化机制。
图4. 黑曲霉角质酶在水相中催化己酸乙酯酯化的特性。
图4. 黑曲霉角质酶在水相中催化己酸乙酯酯化的特性。（a）基于分子动力学（MD）模拟的角质酶ANC1-ANC5的均方根偏差（RSMD）分析。（b）MD模拟后ANC3的比对分析。（c）角质酶催化己酸乙酯酯化的酶活性。（d）角质酶LIP05和LIP05-50的MD模拟及对接分析。（e）角质酶ANC1、ANC2、ANC4和ANC5的对接分析（紫色和绿色：催化位点，蓝色：潜在结合位点）。
️五、水相酯酶酯化特性的研究
在TIP3P水模型中，LIP05表面形成稳定疏水孔道，催化三联体位于孔底，此构型使脂肪酸羧基氧与氧阴离子洞结合，促进催化。己酸乙酯合成后，乙基或因空间位阻占据活性位点，限制LIP05酯水解活性。相比之下，ANC5活性位点位于开放疏水裂隙，Thr132为主要氧阴离子洞，且ANC5酯化活性高于LIP05，或与其缺乏盖帽结构域有关。
分析表明，LIP05疏水孔道非稳定己酸必需，酪氨酸残基对结合至关重要。ANC1和ANC4无法酯化己酸乙酯或因羟基无法与催化残基形成四面体过渡态。基于此，假设水相酯酶酯化脂肪酸需满足：1）脂肪酸与氧阴离子洞稳定结合；2）羟基与催化残基形成四面体过渡态。
图5. 水相酯合成酶的假设催化特性。
️六、黑曲霉CE1和CE5酯合酶的分子模拟鉴定
基于假设催化机制，进一步研究了黑曲霉中的水相酯合成酶。研究表明，CE1和CE5家族酯酶可能具有酯合成能力。在UniProt数据库中，除角质酶外，鉴定出107种CE1和CE5家族酯酶，分析后发现40种同源性低于90%且具有典型Ser-His-Asp催化三联体的酯酶。分子动力学和分子对接分析表明，部分阿魏酸酯酶可能与脂肪酸结合形成酯化催化构象。其中，ANF1-ANF3因结合位点中存在额外酪氨酸而备受关注，其活性位点稳定且暴露于溶液中，表现出高效催化活性。结果表明，酪氨酸构成的氧阴离子洞可能是潜在水相酯合成酶的特征构象之一，且活性位点的静电特性可能影响催化效率。
PICRUSt2预测的真菌群落代谢途径组成。标签
PICRUSt2预测的真菌群落代谢途径组成。标签a、b、c、d、e和f表示不同的代谢途径。Y轴表示相关代谢途径的相对丰度。不同菌种在属水平上对代谢途径的贡献值比例以不同颜色显示。
️七、大曲优势菌种中的潜在水相酯合成酶
除黑曲霉外，金孢曲霉、黄曲霉、微小根毛霉和华丽腐霉等优势真菌均具产生酯合成酶能力，但尚未被鉴定。在UniProt数据库中，鉴定出多种属于这些真菌的非冗余酯酶，具有Tyr-His-Ser-His-Asp催化五元组。此外，谢瓦曲霉等未从高温大曲中分离出的丝状真菌也含此类酯酶，表明其在丝状真菌中广泛存在。谢瓦曲霉中至少有四种具有催化五元组的酯酶，其中两种被揭示为潜在酯合成酶，具有高效合成己酸乙酯的活性。除真菌外，考氏牛肝菌等微生物中也发现类似酯酶。
图8. 优势微生物中潜在高效水相酯合成酶的鉴定。
图8. 优势微生物中潜在高效水相酯合成酶的鉴定。（a）某些优势真菌中具有Tyr-His-Ser-His-Asp催化五联体的潜在酯合成酶（黑色字体：黄曲霉，红色字体：微小根毛霉，绿色字体：绚丽腐霉）。用于催化己酸乙酯酯化的酯酶ACE1（b）、ACE2（c）和KCE1（d）的特性。（e）KCE1在分子动力学模拟过程中的结构变化（0.15 nm以内的均方根偏差聚类分析；绿色：催化与结合位点，黄色：酪氨酸残基）。
️总结
研究阐明了中高温大曲发酵中酯酶活性及酯化微生物的动态变化。酯化活性主要在发酵中后期形成，金孢曲霉、黑曲霉、黄曲霉等丝状真菌是主要贡献者。分子模拟揭示了水相酯合成酶的催化特性，某些丝状真菌的阿魏酸酯酶在水相中能高效催化酯合成，并确定了其特征构象——催化五元组。结果突出了关键酯化微生物和水相酯合成酶。
