就喜欢理财的回答：
方法一： 细菌转化的方法多以mendel和higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的cacl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。 用cacl2製备新鲜或冷冻的大肠桿菌感受态细胞，常用于成批製备感受态细菌。
️感受态细胞的製备和转化中 为什么要加两次cacl2? cacl2为什么要预冷？
热心网友的回答：
感受态的製备，需要儘量排除杂质的汙染，多次离心加cacl2，只是为了使培养基儘量弃去。
感受态的整个製备过程都要求在冰上操作，cacl2需要预冷是显然的操作，以最大限度保证细胞活性和转化效率。
️大肠桿菌感受态细胞製备为什么要用cacl2处理细菌
阿鲁巴星人的回答：
ca离子沉聚在细胞膜表面会使得细胞膜呈一种液晶的状态，这种状态便于在热激条件下形成缝隙，便于转化质粒。
️感受态细胞製备步骤6和8中都加入了cacl2目的一样吗？它们的作用分别是什么
亲咔丨的回答：
： 细菌转化mendelhiga（1970）发现基础其基本用冰预冷cacl2或种2价阳离等处理细菌使进入受态转化 用cacl2製备新鲜或冷冻肠桿菌受态细胞用于批製备受态细
️为什么用cacl2溶液悬浮细胞时必须轻轻悬浮
热心网友的回答：
大肠桿菌感受态细胞的製备和转化準备： 一.材料 e.
coli dh5α菌株:rˉ,mˉ,ampˉ；pbs质粒dna:购买或实验室自制,eppendorf管.
二.装置 恆温摇床,电热恆温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恆温水浴锅,製冰机,分光光度计,微量移液枪. 三.
试剂 1.lb固体和液体培养基 2.amp母液 3.
含amp的lb固体培养基:将配好的lb固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板. 4.
麦康凯培养基(maconkey agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板. 5.
0.05mol/l cacl2溶液:称取0.
28g cacl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌. 6.含15%甘油的0.
05mol/l cacl2:称取0.28g cacl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌.
操作步骤： 一、 受体菌的培养 从lb平板上挑取新活化的e.coli dh5α单菌落,接种于3-5ml lb液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期.
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml lb液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至od600 ＝0.
5左右.
二、 感受态细胞的製备 ( cacl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟. 2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟.
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液. 4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可储存半年.
三、 转化 1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上. 2、 加入pbs质粒dna溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟.
4、向管中加入1ml lb液体培养基(不含amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(ampr ). 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时. 同时做两个对照:
对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替dna溶液,其它操作与上面相同.此组正常情况下在含抗生素的lb平板上应没有菌落出现.
对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替dna溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的lb平板上,此组正常情况下应产生大量菌落.
四、 计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数. 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率**化子数／每mg质粒dna）＝转化子总数／质粒dna加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 [注意] 本实验方法也适用于其它e.
coli受体菌株的不同的质粒dna的转化.但它们的转化效率并不一定一样.有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较準确的计算转化率.
a股缠论的回答：
为什么用cacl2溶液悬浮细胞时必须轻轻悬浮 由于聚氨酯原料和配方的多样性，水性聚氨酯开发40年左右的时间，人们已研究出许多种製备方法和製备配方。水性聚氨酯品种繁多，可以按多种方法分类。
️cacl2製备感受态细胞转化dna时,低温的目的是什么?热休克的温度及目的是什么5
的回答：
冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使dna进入细菌细胞中。这就是原理。
热心网友的回答：
在0～4℃，cacl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基－钙磷酸複合物黏附于细胞表面，较低的温度也降低了相关酶的活性较好的储存了dna的，
这里的冷处理和热激使细胞变成可接受dna状态的作用机理目前是还不为人所知的，自从mendel和higa在2023年发现这一处理效果以来，所有的转化都在这么做，效果还是值得肯定的。
️用cacl2製备感受态细胞怎么总是失败
热心网友的回答：
如果你觉得感受态没有问题，那么就先排除质粒和平板的问题。
转化效率的评估
我们建议转化（如下所述）不同浓度中等大小的质粒（约5kb）来评估转化效率，第一次检验，转化10-9,10-10,10-11g质粒dna比较有意义。製备的最好的能达到108或更多克隆每ug质粒dna，而达到5×106每ug质粒dna可能已经适合做大多数的克隆了。另外，建议把自制的感受态涂到ap+kn板以排除汙染有抗性的杂菌。
10．每个转化用200ul感受态，并将菌体冰浴。
11.加入连线物（5-10ul连线物/200ul菌液），小心弹匀后冰浴30min.
12.42℃热击30s（不用搅动）。
13.置于冰浴2min.
14.加800ul lb并在37℃振荡培养1h以使细胞恢复。
15.1000g离心，然后用200ul lb重悬并涂板，37℃培养过夜。
16.数菌落。如果你没有专门的数菌落的仪器，那么可在平板下垫一层黑色背景以便于观察菌落。
用黑色钢笔在平板的底部标记数过的克隆。转化效率取决于10-6g质粒产生的克隆数量的多少。
nin微的回答：
用试剂盒吧。我们对比过cacl2和试剂盒，cacl2是很杯具的。。。
吕春伟的回答：
怀疑call2的纯度，有条件可换用优级纯试剂
️大肠桿菌感受态细胞製备时的cacl2浓度到底是多少
热心网友的回答：
（1）质粒dna的质量和浓度： 用于转化的质粒dna应主要是超螺旋态的，转化率与外源dna的浓度在一定範围内成正比，但当加入的外源dna的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，dna溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组dna分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组dna大都构成环状双螺旋分子。 （2）感受态细胞的质量：
所用的cacl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配製，最好分装储存于4℃ （3）细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油储存的菌种中直接转接用于製备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的od600控制。对tg1菌株，od600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意od600值与细胞数之间的关係随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。 （二）感受态细胞转化中的影响： 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、dna酶或杂dna所汙染，否则均会影响转化效率或杂dna的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
️cacl2法制感受态细胞：最近用此法制备感受态细胞，但是转化后的效率很低，几天看看平白机会一个没有长。
热心网友的回答：
首先要掌握好培养时间，细胞对数生长期的时候再做，一般od600为0.5左右。其次，在製备的时候要注意一定要整个过程都在冰上，保持低温很重要，特别是离心过程，冷冻离心机要先预冷后再用。
实在不行试试冰浴水洗法吧，操作简单而且电击转化效率很高的。
冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使dna进入细菌细胞中。这就是原理。在0 4 cacl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基 钙磷酸複合物黏附于细胞表面，较低的温度也降...
停止细菌增殖 加入金属离子后，细胞膜低温容易形成液晶态，转化效率高。感受态细胞的製备时有什么注意事项 1 培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 inoue 的高效感受态製备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一 个非常理想方法...
原因 目的基因汇入植物细胞时，由于没有经过钙离子处理没有变成感受态细胞，细胞的通透性小，目的基因难以进入细胞。感受态细胞主要原理 1 通过处理使细胞的通透性变大。2 使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。3 由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。扩充套件资料 氯化钙...
