脂质过氧化物（LPO）检测试剂盒（BODIPY 581591 C11）

一、产品介绍：

BODIPY 581/591 C11是一种 BODIPY氟硼化物类似物，且是一种具有高度亲脂性的比率型荧光探针，可以快速入膜，随后选择性的对细胞内和细胞膜上的脂质过氧化进行捕获，染料由还原态转变为氧化态，该过程中同时伴随着荧光信号的变化，其荧光发射峰从590nm 还原态偏移至 510nm 氧化态。BODIPY 581/591 C11还原态和氧化态发射波光谱能很好分开，对氧自由基、过氧亚硝酸盐比较敏感，对超氧化物、NO、铁离子、H2O2不敏感。

BODIPY 581/591 C11常用于评价活细胞内脂质过氧化和抗氧化性能的研究，也可用于测定铁死亡。铁死亡的主要机制是，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡。

本试剂盒提供的 BODIPY 581/591 C11（1000×）为2mM 储存液，适用于大多数细胞，为了得到更为满意的结果，可以适度调节染料浓度，BODIPY 581/591 C11的终浓度一般为 2-10μM，最优先的推荐终浓度为2μM。本试剂盒提供额外 H2O2（500×）作为阳性诱导剂，通常使用浓度为1×。不同细胞的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度作用时间。

二、试剂盒组成

1. 操作步骤

1.BODIPY 581/591 C11染料工作液配制：

用PBS将BODIPY 581/591 C11（1000×)稀释到1× , 如1μL BODI PY 581/591 C11（1000×)加入到1mL PBS中混合均匀，得2μM BODI PY 581/591 C11，现配现用。

1. 阳性对照设置（可选）
2. 将贴壁细胞以2-5×105个/孔细胞提前过夜铺在6孔板中，用PBS洗涤细胞 2-3次。
3. 加入1mL BODI PY 581/591 C11染料工作液，37℃孵育20-30min，用PBS洗涤细胞2-3 次。
4. 将过氧化氢稀释为1× ：取2μL H2O2（500×)加入到1mL无血清 、无酚红的培养基或 PBS中， 混合均匀。
5. 加入1mL稀释好的过氧化氢，37℃孵育1-4h（不同细胞处理浓度和时间不同，可调整），用PBS洗涤1-2次。
6. 如果用荧光显微镜或共聚焦显微镜，用PBS覆盖后，分别使用GFP和DsRed通道观察。若需要用流式细胞仪器分析，则需无酚红胰酶将细胞消化后用PBS重悬后用FITC和PE通道测试。
7. 结果分析：通常过氧化氢处理后脂质过氧化产物含量大量增加，BODIPY 581/591 C11染色后观察绿色荧光增强，红色荧光减弱；而正常的细胞经 BODIPY 581/591 C11染色后应显示较强的红色 荧光，绿色荧光较弱。

3.悬浮细胞

1. 用PBS将加药处理好的悬浮细胞洗涤2次，并用PBS重悬得到每管细胞数为2×106个的细胞悬液。
2. 再次离心，去上清，加入1mL BODI PY 581/591 C11染料工作液，37℃孵育20-30min，用PBS洗涤细胞2-3次，适量PBS重悬。
3. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用酶标仪或流式细胞仪分析。

4.贴壁细胞

1. 用PBS将加药处理好的6孔板细胞洗涤2-3次 。（也可将细胞用胰酶消化重悬后进行后续实验）
2. 加入1mL BODI PY 581/591 C11染料工作液，37℃孵育20-30min，用PBS洗涤细胞2-3次。
3. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用酶标仪或流式细胞仪分析。

5.参数设置

1. 荧光显微镜或共聚焦拍照：用PBS覆盖后，分别使用GFP和DsRed通道观察；
2. 流式细胞仪分析：用无酚红胰酶将细胞消化后用PBS重悬后用FITC和PE通道测试；
3. 酶标仪分析 ：建议使用黑色96孔板，绿光检测波长500 nm/540 nm，红光 检测波长565 nm/591nm。

四、注意事项

1. 第一次使用时请分装成小包装后-20℃保存，避免反复冻融。
2. 血清 、酚红对本荧光探针的检测有干扰，需避免。
3. 对于加药处理时间小于2h的实验，建议先加探针孵育后再加药处理，效果更佳。
4. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光， 以减缓荧光淬灭。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

五、储存与运输

冰袋（wet ice）运输；-20℃避光保存，6 个月有效。