CaCl2製备感受态细胞转化DNA时,低温的目的是什么 热休

的回答：

冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使dna进入细菌细胞中。这就是原理。

热心网友的回答：

在0～4℃，cacl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基－钙磷酸複合物黏附于细胞表面，较低的温度也降低了相关酶的活性较好的储存了dna的，

这里的冷处理和热激使细胞变成可接受dna状态的作用机理目前是还不为人所知的，自从mendel和higa在2023年发现这一处理效果以来，所有的转化都在这么做，效果还是值得肯定的。

️转化感受态细胞的目的是什么转化感受态细胞的前因后果

热心网友的回答：

感受态细胞指的是经处理后，处于能吸收周围环境中dna分子生理状态的微生物细胞，在转基因技术操作过程中要将重组dna分子汇入微生物受体细胞时就需要用感受态细胞。所谓转化是目的基因进入受体细胞并在受体细胞中维持稳定和表达的过程。（1）质粒dna的质量和浓度，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，则会使转化率下降;ml左右，且注意防止被其它试剂。

（应注意od600值与细胞数之间的关係随菌株的不同而不同），大于30kb的重组质粒将很难进行转化：所用的cacl2等试剂均需是最高纯度的。对tg1菌株。

所有的试剂都要灭菌。对于以质粒为载体的重组分子而言： 用于转化的质粒dna应主要是超螺旋态的，并经高压灭菌处理，1ng的cccdna即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

一般地。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳，所用器皿，并用最纯净的水配製，细胞密度在5×107个/：整个操作过程均应在无菌条件下进行，分子量大的转化效率低，移液枪头等最好是新的，不能离开冰浴，重组dna分子的构型与转化效率也密切相关，否则细胞转化率将会降低，可通过测定培养液的od600控制、dna酶或杂dna所汙染，转化率与外源dna的浓度在一定範围内成正比。

密度过高或不足均会使转化率下降。不要用已经过多次转接。（二）感受态细胞转化中的影响。

（2）感受态细胞的质量。整个操作均需在冰上进行，但当加入的外源dna的量过多或体积过大时，dna溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，实验证明，及贮存在4℃的培养菌液，因此重组dna大都构成环状双螺旋分子，最好分装储存于4℃ （3）细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油储存的菌种中直接转接用于製备感受态细胞的菌液。即应用对数期或对数生长前期的细菌，否则均会影响转化效率或杂dna的转入，od600为0．5时，如离心管

️製备感受态细胞的关键是什么

anyway丶的回答：

製备感受态细胞的关键是将外源dna分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

️扩充套件资料

製作方法

cacl2法

1.将快速生长的大肠桿菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞

细胞膜通透性发生变化，极易与外源dna相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙複合物。

联合其它的二价金属离子（如mn、co）、dmso或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源dna就可能被细胞吸收。进入细胞的外源dna分子通过複製、表达，实现遗传资讯的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源dna分子的阳性克隆。

电转法电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使dna进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环dna。

热心网友的回答：

儘量使细胞保持在低温下，可冰浴，这样可降低细胞代谢率，防治细胞的大量死亡。因为无培养基，代谢强，则会引起大量细胞死亡。

浙大阿米巴的回答：

热激的时间和操作速度掌握好

️当质粒转化进大肠桿菌时，通过什么原理表达目的基因

听风的回答：

当质粒来转化进大肠桿菌时，通过源dna複製原理表达目的基因。

baicacl2对特定du的大肠桿菌处理，製备感受zhi态的细菌。dao这些细菌可使每微克超螺旋质粒dna，如一些插入目的dn**段的重组质粒，产生5×106~2×107 个转化的菌落。当质粒与这些大肠桿菌混合后，质粒粘附在大肠桿菌的表面，在42℃的温度时，大肠桿菌出现热休克，质粒可通过大肠桿菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。

随后，加入lb培养液，于37℃振动培养可使细菌复甦，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠桿菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。

由于大肠桿菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠桿菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠桿菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠桿菌，是经过实验室改造过的工程菌。）

️大肠桿菌感受态细胞製备时的cacl2浓度到底是多少

热心网友的回答：

（1）质粒dna的质量和浓度： 用于转化的质粒dna应主要是超螺旋态的，转化率与外源dna的浓度在一定範围内成正比，但当加入的外源dna的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，dna溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组dna分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组dna大都构成环状双螺旋分子。 （2）感受态细胞的质量：

所用的cacl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配製，最好分装储存于4℃ （3）细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油储存的菌种中直接转接用于製备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。

即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的od600控制。对tg1菌株，od600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意od600值与细胞数之间的关係随菌株的不同而不同）。

密度过高或不足均会使转化率下降。 （二）感受态细胞转化中的影响： 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。

所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、dna酶或杂dna所汙染，否则均会影响转化效率或杂dna的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

️感受态细胞的製备时有什么注意事项

天寂无痕的回答：

1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 inoue 的高效感受态製备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一

个非常理想方法。

2、在储存感受态时，dmso 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

3、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后储存于超低温冰箱内。

4、冻存的感受态用一次拿一管，不要反覆冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。

5、操作时可以轻弹轻甩，儘量避免用移液器吹吸。

y神级第六人的回答：

（1）质粒dna的质量和浓度：

用于转化的质粒dna应主要是超螺旋态的，转化率与外源dna的浓度在一定範围内成正比，但当加入的外源dna的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，dna溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。

此外，重组dna分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组dna大都构成环状双螺旋分子。

（2）感受态细胞的质量：

所用的cacl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配製，最好分装储存于4℃

（3）细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油储存的菌种中直接转接用于製备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。

即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的od600控制。对tg1菌株，od600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意od600值与细胞数之间的关係随菌株的不同而不同）。

密度过高或不足均会使转化率下降。

（二）感受态细胞转化中的影响：

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、dna酶或杂dna所汙染，否则均会影响转化效率或杂dna的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

️农桿菌的感受态细胞里带有ti质粒吗

热心网友的回答：

农桿菌之所以被用于转基因工程，就是其含有ti质粒，ti质粒上的t-dna上有8个左右的回

基因在植物细答胞内表达，农桿菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将t-dna插入到植物基因组中。因此，可以通过将目的基因插入到经过改造的t-dna区，藉助农桿菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。

方法一 细菌转化的方法多以mendel和higa 1970 的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的cacl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。用cacl2製备新鲜或冷冻的大肠桿菌感受态细胞，常用于成批製备感受态细菌。感受态细胞的製备和转化中 为什么要加两次cacl2？cacl2为什么...

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